Procedimento agar

[Terenzio_Terenzio]

Ciao ragazzi,
Vorrei fare un post (più per me stesso) per ordinare le idee sul procedimento da seguire x l agar agar.

Partendo dal presupposto di seguire la guida della wiki per la preparazione etc etc, le cose che faccio saranno:
1) mixare agar con lme
2) versare acqua bollente e miscelare fino all'ottenimento della miscela corretta
3) se recupero un buon termometro aspetto intorno ai 50C e poi preparo le piastre

Qui prima domanda: la SAB l'ho recuperata, ma non ho ben capito se devo spruzzare o meno acqua saponata prima di iniziare a lavorare. Con l'acqua saponata sul fondo dove appoggio le piastre? Sul fondo bagnato o ci metto un rialzo?in generale la strumentazione non la tengo a contatto con l'acqua saponata?

4) una volta preparate e versate, le impilo e aspetto un paio di ore prima di usarle.

Seconda domanda: se non le voglio usare tutte, le posso ficcare tranquillamente in frigo giusto?
Inoltre non avendo un inoculation loop pensavo di usare il bisturi sterilizzato grattando delle spore dall'impronta e distribuendo sulle varie piastre.

La mia idea è di fare 20 piastre di cui 10 per germinazione e 10 tenute in frigo per fare eventuali transfer o per inocularle più in là.

Dite che più o meno mentalmente ci sono col procedimento?

[asklepios]

La miscela deve essere obbligatoriamente sterilizzata, anche se penso lo dessi per scontato.

L'acqua la spruzzi su tutte le pareti, anche il fondo. L'unica cosa che viene a contatto è il fondo delle piastre (e della bottiglia dell'agar), ma non è un problema perché è l'interno che è sterile. Quando poi le sigilli e le lasci in giro o in una scatola sono a contatto con l'aria e l'esterno non è più sterile in ogni caso. Detto questo, strumentazione come il bisturi e quant'altro se viene a contatto con qualsiasi superficie che non sia l'interno delle piastre deve essere fiammeggiato prima di essere utilizzato.

Le piastre versate, se sono versate bene, in teoria potresti conservarle anche fuori dal frigo, in quanto non dovrebbero esserci batteri al loro interno e gli ingredienti dell'agar sono abbastanza stabili, principalmente acqua e zuccheri. Detto questo, alcuni venditori di piastre pre-versate consigliano di conservarle in frigo, altri a temperatura ambiente. Se hai spazio in frigo le puoi mettere lì, altrimenti anche lasciarle fuori dovrebbe andare. Vedi poi tu se riconservarle nella busta in cui sono arrivate o se sigillarle una per una.

Per l'inoculazione puoi usare il bisturi o un cotton-fioc sterile, va benissimo. Se non trovi in farmacia i cottonfioc sterili usa tranquillamente il bisturi, che riesci a prendere più spore. Importante raffreddare il bisturi sull'agar prima di andare a raccogliere le spore, ne sopravvivono di più e l'umidità extra aiuta a farle attaccare.

Dieci piastre di germinazione secondo me sono anche tante. Se lavori con un'impronta sporale pulita e hai buona tecnica 5 sono più che sufficienti, fai 7 per sicurezza. Non scoraggiarti se dovrai buttare tutto all'inizio per batteri, è normale le prime volte, è solo questione di pratica.

Sono contento che più persone si avvicinino all'agar, sei già il secondo che incontro su questo forum. Buona fortuna!

[Terenzio_Terenzio]

Si davo per scontato la sterilizzazione della miscela. Perfetto, come sempre sei preciso ed efficace!
Lunedì dovrei mettermi in opera, vi tengo aggiornati!

[Terenzio_Terenzio]

Quindi, ricapitolando, oltre alla sterilizzazione e quanto detto sopra, accorgimenti che devo prendere sono:
1) metto parafilm singolarmente su ogni piastra, a prescindere che la usi subito o meno (qui ho un dubbio, se ho idea di usarne 5 subito o cmq nel giro di poche ore, non ha molto senso mettere e togliere il parafilm)
2) una volta indurite le piastre, le metto tutte a testa in giù, che siano inoculate o meno
3) aspetto

Una volta cresciuto il micelio, i transfer li posso fare solo da petri sana a petri "vuota" o posso anche provare a isolare parte di micelio buono da una piastra contaminata?

Inoltre non ho un "cannello" o come si chiama per la fiamma libera, mi può bastare un accendino?

[asklepios]

C'è chi le sigilla una per una, c'è chi le conserva direttamente nella busta in cui sono arrivate. Sono comunque progettate per proteggere la parte interna, quindi a meno di correnti d'aria eccessive non dovresti avere problemi di contaminazione. In ogni caso se si dovessero contaminare perché non le hai sigillate la contaminazione sarebbe vicino al bordo penso. Sul fatto di metterle a testa in giù, io non l'ho mai fatto, in quanto ho letto che così tendono a seccarsi. So che è pratica diffusa quando si fanno colture batteriche, non so, vedi tu, non penso faccia quella gran differenza. Nota aggiuntiva se usi il parafilm, per usarne meno basta tagliarlo in striscioline ci circa 1 centimetro e mezzo (vai un po' ad occhio), deve solo coprire lo spazietto tra i due pezzi della Petri.

Una volta cresciuto il micelio, i transfer li posso fare solo da petri sana a petri "vuota" o posso anche provare a isolare parte di micelio buono da una piastra contaminata?

Beh lo scopo di utilizzare l'agar è proprio quello. Soprattutto se l'impronta sporale non è stata presa con la tecnica migliore è molto probabile che insieme al micelio cresceranno batteri e muffe, e grazie all'agar sei in grado di isolare il micelio. Se poi sei fortunato ottieni solo il micelio, ma ti consiglio comunque di fare almeno uno o due trasferimenti per sicurezza.

Inoltre non ho un "cannello" o come si chiama per la fiamma libera, mi può bastare un accendino?

L'attrezzo dovrebbe diventare arancione, se con l'accendino riesci allora va bene. Forse con quelli antivento che hanno la fiamma blu ti puoi trovare meglio dato che scaldano di più. Neanche io ho il cannello purtroppo, anche perché è abbastanza ingombrante, e uso il fornello della cucina, dove faccio tutto il mio lavoro sterile.

[Terenzio_Terenzio]

C'è chi le sigilla una per una, c'è chi le conserva direttamente nella busta in cui sono arrivate. Sono comunque progettate per proteggere la parte interna, quindi a meno di correnti d'aria eccessive non dovresti avere problemi di contaminazione. In ogni caso se si dovessero contaminare perché non le hai sigillate la contaminazione sarebbe vicino al bordo penso. Sul fatto di metterle a testa in giù, io non l'ho mai fatto, in quanto ho letto che così tendono a seccarsi. So che è pratica diffusa quando si fanno colture batteriche, non so, vedi tu, non penso faccia quella gran differenza. Nota aggiuntiva se usi il parafilm, per usarne meno basta tagliarlo in striscioline ci circa 1 centimetro e mezzo (vai un po' ad occhio), deve solo coprire lo spazietto tra i due pezzi della Petri.

Una volta cresciuto il micelio, i transfer li posso fare solo da petri sana a petri "vuota" o posso anche provare a isolare parte di micelio buono da una piastra contaminata?

Beh lo scopo di utilizzare l'agar è proprio quello. Soprattutto se l'impronta sporale non è stata presa con la tecnica migliore è molto probabile che insieme al micelio cresceranno batteri e muffe, e grazie all'agar sei in grado di isolare il micelio. Se poi sei fortunato ottieni solo il micelio, ma ti consiglio comunque di fare almeno uno o due trasferimenti per sicurezza.

Inoltre non ho un "cannello" o come si chiama per la fiamma libera, mi può bastare un accendino?

L'attrezzo dovrebbe diventare arancione, se con l'accendino riesci allora va bene. Forse con quelli antivento che hanno la fiamma blu ti puoi trovare meglio dato che scaldano di più. Neanche io ho il cannello purtroppo, anche perché è abbastanza ingombrante, e uso il fornello della cucina, dove faccio tutto il mio lavoro sterile.

ah sai che anche io ho sempre usato la zona fornello! accendo tutti i fuochi e posiziono la roba da inoculare al centro, tra tutti i fornelli accesi. Mai avuto grossi problemi di contaminazione, un amico mi disse che la zona in centro è priva di contaminanti molto più che farlo sul tavolo disinfettato, e devo dire che ha ragione, a parte una tortina PF non ho mai avuto una contaminazione da inoculazione con siringhe. Stasera appena arrivo a casa parto con l'agar, non vedo l'ora!

[asklepios]

Sì è vero, sicuramente hai meno contaminanti che non sul tavolo disinfettato, è una pratica che si usava molto in passato e ne trovi ancora menzioni in manuali di biologia datati. Ormai con l'avvento delle cappe a flusso a laminare, che garantiscono la sterilità, si preferisce ovviamente usare quelle. La SAB in teoria dovrebbe avere efficienza comparabile a quella di una cappa a flusso laminare. Per una tortina comunque anche usare la SAB o cappa non penso faccia tanto la differenza, in quanto c'è comunque lo strato di vermiculite asciutta che dovrebbe proteggere dai batteri. Fammi sapere come va l'agar!

[Terenzio_Terenzio]

certo! credo posterò qualcosa a lavori finiti