Metodo alternativo per ripulire il micelio da contaminazioni batteriche

[albert ergot]

Condivido un paper che qualcuno ha menzionato su Shroomery:

A handy method to remove bacterial contamination from fungal cultures

Dall'abstract:

Therefore, in the present work, we developed a new method for bacterial removal from fungi cultured on solid medium, the Cabin-Sequestering (CS) method, based on the different culture characteristics between fungi and bacteria. First, 3–5 mm round or square holes (the “cabin”) are excavated on a solid medium plate. The fungal strain containing possible bacterial contamination is inoculated into the cabin. The cabin is then covered with a sterilized coverslip, followed by incubation at the appropriate temperature. After 7–10 days of culturing, fungal hyphae grow out along the edge of the coverslip; however, the contaminating bacteria cannot pass through the space formed between the medium and the coverslip and, thus, remain in the cabin.

Probabilmente overkill per molti, ma credo sia un'idea interessante, quantomeno da conoscere.

[ElnathB7III]

Grazie tanto, tornerà utile. Cosa intendi con overkill? difficile da fare?

[albert ergot]

Grazie tanto, tornerà utile. Cosa intendi con overkill? difficile da fare?

Che probabilmente nella pratica hobbystica, dove le contaminazioni sono principalmente muffette o vistose contaminazioni batteriche comunque ben chiare e isolate, forse non ce n'è bisogno.

Difficile non saprei, non vanno troppo in dettaglio sui passi, l'idea mi sembra interessante, ma vedo dei problemi di applicazione...

[ElnathB7III]

Che probabilmente nella pratica hobbystica, dove le contaminazioni sono principalmente muffette o vistose contaminazioni batteriche comunque ben chiare e isolate, forse non ce n'è bisogno.

Difficile non saprei, non vanno troppo in dettaglio sui passi, l'idea mi sembra interessante, ma vedo dei problemi di applicazione...

Potrebbe non essercene bisogno, ma è una tecnica veloce che sembra efficace e soprattutto semplice.
La semplicità è la maggiore delle sofisticazioni.
Non so quali siano i problemi di applicazione, forse solo l'accessibilità ad un buon incubatore. Del resto non ho letto tutto il paper, ma lo farò per preparami alla mia di coltivazioni. Poi ci scambiamo i risultati

[albert ergot]

Non so quali siano i problemi di applicazione

Che non spiega esattamente alcune parti fondamentali, forse è ovvio per gli addetti ai lavori... io mi sono immaginato che:

1. per ogni trasferimento ti servono due piastre vergini;
2. nella prima incidi questa buca diciamo quadrata (già lì non facile) fino ad arrivare al vetro praticamente (?) e butti via il pezzo;
3. dalla piastra colonizzata prendi un pezzo più piccolo della buca e ce lo metti dentro;
4. dalla seconda piastra prendi un pezzo più grande della buca e lo metti a coprire (per niente facile).
5. dopo giorni trasferisci ciò che esce.

[ElnathB7III]

Che non spiega esattamente alcune parti fondamentali, forse è ovvio per gli addetti ai lavori... io mi sono immaginato che:

1. per ogni trasferimento ti servono due piastre vergini;
2. nella prima incidi questa buca diciamo quadrata (già lì non facile) fino ad arrivare al vetro praticamente (?) e butti via il pezzo;
3. dalla piastra colonizzata prendi un pezzo più piccolo della buca e ce lo metti dentro;
4. dalla seconda piastra prendi un pezzo più grande della buca e lo metti a coprire (per niente facile).
5. dopo giorni trasferisci ciò che esce.

Perchè dici che non è facile coprire il buco con un pezzo di un'altra piastra? perchè c'è il rischio che si sposti esponendo il micelio?

[albert ergot]

1. per ogni trasferimento ti servono due piastre vergini;
2. nella prima incidi questa buca diciamo quadrata (già lì non facile) fino ad arrivare al vetro praticamente (?) e butti via il pezzo;
3. dalla piastra colonizzata prendi un pezzo più piccolo della buca e ce lo metti dentro;
4. dalla seconda piastra prendi un pezzo più grande della buca e lo metti a coprire (per niente facile).
5. dopo giorni trasferisci ciò che esce.

Buono non avevo capito niente, si copre con un vetrino da microscopio, non con altro agar, quindi sì è più facile.

Perchè dici che non è facile coprire il buco con un pezzo di un'altra piastra? perchè c'è il rischio che si sposti esponendo il micelio?

Che si sposti una volta messo no, è solo che maneggiare l'agar appiccicaticcio, dentro la SAB, dove già vedi poco e ti muovi male, stando anche attendo a non sporcare tutto, richiede abbastanza pratica.

[ElnathB7III]

Buono non avevo capito niente, si copre con un vetrino da microscopio, non con altro agar, quindi sì è più facile.

Ah ecco, credevo di essere io a non averci capito niente, ahaha

[albert ergot]

Ho provato questo metodo con delle piastre colonizzate che tenevo in frigo. Serve non poca manualità per maneggiare l'agar: sia per fare la buca iniziale che per metterci dentro quello trasferito, che a differenza del solito deve aderire sul fondo di vetro della piastra tendendo quindi a rimanere attaccato al bisturi. Probabilmente usare più agar agar nella ricetta potrebbe aiutare, poiché l'agar risulterebbe più solido, quindi più scavabile, ma forse anche più difficile da penetrare per il micelio?

Ma il problema più grosso è stato maneggiare i vetrini, li ho sterilizzati in una busta di stagnola e ovviamente a causa dell'umidità sono diventati difficilissimi da separare, ne ho anche spezzato uno, considerando che vanno maneggiati con delle pinzette o simili, sterilizzate ogni volta su una fiamma. Col senno di poi forse sarebbe stato meglio sterilizzarli disposti in verticale, separati, usando un qualche tipo di supporto.

Ora le piastre le ho messe in incubatore, vedramo... non mi aspetto chissà cosa, anche perché questo metodo richiede molti passaggi e ognuno è un'opportunità per ulteriori contaminazioni.

[ElnathB7III]

Ho provato questo metodo con delle piastre colonizzate che tenevo in frigo. Serve non poca manualità per maneggiare l'agar: sia per fare la buca iniziale che per metterci dentro quello trasferito, che a differenza del solito deve aderire sul fondo di vetro della piastra tendendo quindi a rimanere attaccato al bisturi. Probabilmente usare più agar agar nella ricetta potrebbe aiutare, poiché l'agar risulterebbe più solido, quindi più scavabile, ma forse anche più difficile da penetrare per il micelio?

Ma il problema più grosso è stato maneggiare i vetrini, li ho sterilizzati in una busta di stagnola e ovviamente a causa dell'umidità sono diventati difficilissimi da separare, ne ho anche spezzato uno, considerando che vanno maneggiati con delle pinzette o simili, sterilizzate ogni volta su una fiamma. Col senno di poi forse sarebbe stato meglio sterilizzarli disposti in verticale, separati, usando un qualche tipo di supporto.

Ora le piastre le ho messe in incubatore, vedramo... non mi aspetto chissà cosa, anche perché questo metodo richiede molti passaggi e ognuno è un'opportunità per ulteriori contaminazioni.

Dalla descrizione non ho capito bene come hai fatto, posteresti una foto? volevo usarlo pure io questo metodo prima di iniziare la coltivazione

[albert ergot]

Dalla descrizione non ho capito bene come hai fatto, posteresti una foto? volevo usarlo pure io questo metodo prima di iniziare la coltivazione

Purtroppo si vede male che c'è ancora un po' di condensa, forse anche dovuta all'incubatore. Se apri il link e zoommi puoi notare che nell'agar ho ritagliato (in questa piastra ahime particolarmente male) un tassello, nel buco ho messo un pezzo di agar da un'altra piastra colonizzata (nella foto non si vede il micelio) e ho coperto il tutto con il vetrino.

[ElnathB7III]

Purtroppo si vede male che c'è ancora un po' di condensa, forse anche dovuta all'incubatore. Se apri il link e zoommi puoi notare che nell'agar ho ritagliato (in questa piastra ahime particolarmente male) un tassello, nel buco ho messo un pezzo di agar da un'altra piastra colonizzata (nella foto non si vede il micelio) e ho coperto il tutto con il vetrino.

Io continuo a non capire tanto bene cosa tu abbia fatto. Intanto perchè hai dovuto tagliare l'agar? non bastava prendere un pezzo di micelio e poggiarlo sull'agar? poi tu hai fatto un buco sul tappo della piastra e l'hai coperto con un vetrino. Ora vediamo se ho capito bene, la piastra ha una sua altezza, il micelio dovrebbe crescere in altezza ed infilarsi nello spazio tra il tappo della piastra ed il vetrino uscendo così fuori e lasciando all'interno eventuali flore batteriche? poi tu tagli quello che esce fuori e quello è pulito?

[albert ergot]

Io continuo a non capire tanto bene cosa tu abbia fatto. Intanto perchè hai dovuto tagliare l'agar? non bastava prendere un pezzo di micelio e poggiarlo sull'agar?

Quello che dici è quello che di solito si fa durante i trasferimenti normali, ma se il micelio è in qualche modo contaminato da batteri (non sto dicendo che sia il mio caso, né che sia una cosa comune, ma è l'obiettivo dell'articolo) continuerai a trasferire micelio contaminato. L'idea dei ricercatori è che il forzare il micelio a passare attraverso l'agar lo ripulirebbe da eventuali contaminazioni batteriche, che per qualche motivo non riuscirebbero a passare.

Si usa il vetrino per costringere il micelio ad attraversare l'agar e quindi occorre una buchetta per poter creare una camera dove sotto c'è il fondo della piastra (vetro), sopra c'è il vetrino, e intorno agar. Il micelio espandendosi dal pezzo di agar nel mezzo della camera dovrebbe crescere verso e attraverso l'agar. Quindi, crescendo verso l'esterno e una volta superata la superficie del vetrino si potrà di nuovo trasferire normalmente in una nuova piastra e ripartire da lì.

poi tu hai fatto un buco sul tappo della piastra e l'hai coperto con un vetrino. Ora vediamo se ho capito bene, la piastra ha una sua altezza, il micelio dovrebbe crescere in altezza ed infilarsi nello spazio tra il tappo della piastra ed il vetrino uscendo così fuori e lasciando all'interno eventuali flore batteriche? poi tu tagli quello che esce fuori e quello è pulito?

No, allora. Partendo da una piastra colonizzata e una vergine, il procedimento a gradi linee (escludendo le operazioni di sterilizzazione e igiene) è il seguente:

1. si effettua un buco (più piccolo del vetrino) in mezzo all'agar della piastra vergine, quindi effettivamente arrivando ad esporre il vetro del fondo (il tassello di agar si butta);
2. si prende un pezzo di agar colonizzato (più piccolo del buco) dall'altra piastra;
3. si mette quest'ultimo all'interno del buco e si ricopre il tutto con il vetrino.

Ecco uno schema in sezione (il coso bianco è micelio):



Ti sconsiglio comunque di usare questo metodo ai tuoi primi tentativi, soprattutto se non ne hai un motivo valido.

[ElnathB7III]

1. si effettua un buco (più piccolo del vetrino) in mezzo all'agar della piastra vergine, quindi effettivamente arrivando ad esporre il vetro del fondo (il tassello di agar si butta);
2. si prende un pezzo di agar colonizzato (più piccolo del buco) dall'altra piastra;
3. si mette quest'ultimo all'interno del buco e si ricopre il tutto con il vetrino.

Ecco uno schema in sezione (il coso bianco è micelio):



Ti sconsiglio comunque di usare questo metodo ai tuoi primi tentativi, soprattutto se non ne hai un motivo valido.

Sei un grande, grazie ho capito. Io pensavo di usarlo perchè mi sembra togliere quasi ogni dubbio di contaminazione batterica, almeno da un punto di vista teorico. Per cui così mi assicuro che la mia coltivazione sia sana sin da subito. Quando devo prendere il micelio allora? quando passa attraverso l'agar oltre la copertura del vetrino?

[ElnathB7III]

La difficoltà del batterio quindi qual è? superare la sezione di aria, vuota dove non c'è agar? o penetrare nell'agar una volta raggiunto?

[albert ergot]

Quando devo prendere il micelio allora? quando passa attraverso l'agar oltre la copertura del vetrino?

A regola sì, dovrebbe alla fine tornare in superficie, oltre il vetrino, a quel punto fai un normale trasferimento. I ricercatori consigliano "il prima possibile", consiglio che comunque vale in generale:

However, it cannot be completely ruled out that some bacteria may be able to go through the culture medium and grow out of the small cabin together with the fungal hyphae. Therefore, we prefer to pick the newly generated hyphae around the coverslip as soon as possible and to only pick the hyphal tips.

La difficoltà del batterio quindi qual è? superare la sezione di aria, vuota dove non c'è agar? o penetrare nell'agar una volta raggiunto?

Da quello che ho capito è la seconda, attraversare l'agar, non so se il batterio viene solo rallentato o se proprio (in generale) non riesce. Fatto sta che nel paper si menzionano altri metodi alternativi e tutti si basano sullo stesso principio alla fine.

[albert ergot]

Ebbene, non ci speravo, ma alla fine dopo una settimana, da quasi ogni piastra il micelio è riuscito ad emergere oltre il vetrino. Mi sarei immaginato di vedere chiaramente i filamenti attraversare l'agar, invece si nota solo la chiazza di micelio superficiale. Magari è così che deve comportarsi, oppure c'è qualcosa di totalmente sbagliato, chissà... Domani proverò i trasferimenti.

[albert ergot]

Curioso, evidentemente i filamenti di micelio dentro l'agar sono sottilissimi e difficilmente si vedono ad occhio nudo. Comunque sembra tutto ok, alla fine 7 piastre su 7 hanno avuto successo. Ecco un'altra foto dopo il trasferimento, dove si vede meglio il setup.

[asklepios]

Che roba! Complimenti per l'esecuzione.

[albert ergot]

Che roba! Complimenti per l'esecuzione.

Grazie!

È successa una cosa curiosa, o almeno che non mi era mai capitata. Il micelio di una delle piastre risultanti dai trasferimenti di quelle provenienti da questo metodo, è venuto molto tomentoso e vigoroso, molto bianco, a differenza del solito. L'odore sembra buono e andando col dito a toccare si nota sotto un bello strato bianco, mentre solitamente è quasi sempre solo qualche ramo del micelio che resiste al passaggio del dito.

Non so se è questo il caso, ma l'articolo in questione riporta:

We have found that after CS treatment, aside from the removal of the contaminating bacteria, the fungal characteristics, including sporulation, melanin production and pathogenicity, were also improved, while antibiotic treatment rarely produced such effects. The reason for this phenomenon may be that the fungus growing in the cabins has to break through the restrictions imposed by the coverslip and culture medium to grow out, which likely represents an automatic screen for fungal cells in better health and higher vitality.

In questi ultimi mesi ho fatto un sacco di trasferimenti con queste piastre e benché ci fosse sempre una certa variabilità, questo tipo di micelio l'ho visto solo una volta, originato da una siringa acquistata che poi alla fine non ha prodotto nulla.

Vedremo, per adesso le piastre le ho messe in frigo e verso primavera proverò la coltivazione.

PS Ben tornato! Era un po' che non scrivevi, spero tutto bene.